wb实验的原理和步骤
与相应的第一抗体特异性结合，然后与酶或同位素标记的第二抗体结合，最后通过底物显色或放射自显影检测特定目的基因表达的蛋白质组分。
蛋白质样品制备
原始样品可以是细胞、组织、培养上清液、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白质。以下为目的蛋白定性检测的细胞样品处理方法，其余样品制备方法参考相关文献。
1.培养细胞或药物治疗。
2.丢弃培养基，用1X PBS冲洗细胞两次，以去除残留的培养基。
3.添加1X SDS样品缓冲液，刮去细胞并转移至Ep管。注意:在冰上操作。
4.超声波切割DNA 10 ~ 15秒，降低样品粘度。
5.将样品煮沸5分钟。
6.离心12000g 5min，取上清液。
SDS-PAGE电泳
首先，清洁玻璃板
第二，胶水和样品
1.玻璃板对齐后，放入夹具中夹紧。然后垂直贴在架子上准备倒胶。
2.与10%分离胶混合，加入TEMED，并在倒胶前立即摇匀。倒胶时，可用10ml枪吸5ml胶，沿玻璃释放，直至胶面上升至绿化带中线高度。然后在胶里加一层水，液封后凝胶会更快。
3.当水和胶水之间有折射线时，说明胶水已经凝固。等3分钟胶水完全凝固后，就可以把胶水上层的水倒掉，用吸水纸吸干。
4.混合4%的浓缩胶，加入TEMED，立即摇动即可倒胶。用浓缩胶填满剩余的空间，然后将梳子插入浓缩胶中。当浓缩胶凝固后，双手握住梳子两侧，轻轻垂直向上拔出。
5.用水冲洗浓缩凝胶，放入电泳槽中。
6.在电泳槽的上下槽中加入1×Tris-甘氨酸或SDS电泳缓冲液，上样。
7.将电泳槽连接到电泳仪器。上槽连接到负电极，下槽连接到正电极。起电电压70 ~ 80 V，10min后100V，电泳2小时或溴酚蓝从底部迁移到1cm时停止电泳。
旋转胶片
1.将胶水浸泡在转移缓冲液中，并平衡10分钟。注意:如果检测的是小分子蛋白，这一步可以省略，因为小分子蛋白容易扩散出凝胶。
2.根据胶水的大小，剪下6片膜和滤纸，放入转移缓冲液中平衡10分钟。如果使用PVDF膜，需要用纯甲醇饱和3-5秒。
3.组装转移夹层:海绵3层滤纸膜，3层滤纸海绵。每层放好后，用试管驱赶气泡。记住:胶水放在反面(黑面)。
4.将转移槽放入冰浴中，放入三明治(黑色面对黑色)，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h(电流约为0.3A)。
5.膜转移完毕后，切断电源，取出混合膜。
闭合和杂交
1.用25毫升TBS在室温下冲洗膜5分钟，并摇动。
2.室温下，将膜置于25ml封闭缓冲液中65438±0h，并摇动。
3.15mlTBS/T/t共3次(5min/T)。
4.加入适当稀释的一抗，在室温下孵育1-2h或4°C过夜，并缓慢摇动。
5.1.5毫升TBS/t，共3次(5min/T)。
6.加入适当稀释的碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育65438±0h，缓慢摇匀。
7.1.5毫升TBS/t，共3次(5min/T)。
8.15毫升TBS洗1次。五
着色
将发光液体A和发光液体B按比例稀释混合。用去离子水将膜稍冲洗干净，将滤纸在边角吸干，用反贴法盖在A、B混合液滴上，关灯至可见淡绿色荧光带(约5分钟)，再将滤纸在边角吸干，放入保鲜膜中固定在膜盒中，迅速盖上膜，合上塑料盒，根据所见荧光强度曝光。
取出胶片，立即浸入显影液中1 ~ 2 min。用清水冲洗干净，放入定影液中，直到胶片完全固定。用清水冲洗干净，晾干。标记它，分析和扫描它。
WB中常见问题及解决方法。
首先，信号强度低
信号强度低是指正常曝光条件下得到的目标条带很小或没有目标条带，增加曝光时间会导致背景高、杂带多等问题。扫除试剂质量和操作失误的影响，产生这类问题的主要原因如下:
①样品中缺乏蛋白质表达。建议增加高蛋白表达的细胞系作为阳性对照，或适当增加样本量以获得更高程度的信号；
②蛋白质降解。蛋白质样品制备过程中注意蛋白酶抑制剂PMSF的使用，对制备好的样品尽快检测或妥善保存；
③蛋白质转移。对于高分子量蛋白质来说，使用具有合适孔径的膜并优化膜转移时间可能需要更长的膜转移时间。
④抗体的应用。抗体的反应种类和实验类型能满足实验的需要。此外，抗体的稀释比例和孵育时间也需要在实验中不时优化。
⑤蛋白质与抗体的分离率低。减少洗膜次数或缩短洗膜时间，降低洗膜液中NaCl的浓度等。
⑥抗原被封闭液覆盖。改用不同的封闭液，优化封闭液中蛋白质的浓度，缩短封闭时间；
⑦甲醇浓度过高。蛋白质会从SDS中分离出来，沉淀在凝胶中，同时使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白质的转移。实验中可以适当降低甲醇的浓度或者用乙醇和异丙醇代替。
第二，非特异性条带或条带位置错误。
WB结果中靶带以外的带称为非特异性带，有时非特异性带很明显，但没有靶带，会对结果的分析产生很大干扰。一般来说，导致这些问题的主要因素有:
①抗体的非特异性分离。一般认为多克隆抗体的特异性不如单克隆抗体，更容易产生非特异性条带，适当降低抗体浓度有助于减少杂带。同时，为了排除二抗非特异性分离的可能性，建议设置二抗阴性对照；
②样品蛋白质含量过高。适当减少上样量，延长洗涤时间和封闭时间，可以防止高蛋白质含量对实验结果的不利影响；
③蛋白质降解。会导致条带位置的改变，产生更多的杂带，建议采用新制备的或冻融次数少的样品；
④细胞传代次数过多。会导致蛋白质表达形式的分化，建议使用原始或传代较少的细胞系；
⑤蛋白质有复合物。一些目标蛋白会与其他蛋白分离形成复合物，从而导致条带位置的改变。需要查阅相关文献来确认蛋白质是否能形成稳定的复合物。
⑥蛋白质中存在剪接或各种修饰。局部蛋白质中存在剪切位点，部分剪切体具有免疫活性，在WB中也会检测到。此外，一些目标蛋白会有糖基化位点或其他修饰位点，条带大小可能远远超过理论分子量。因此，需要查阅文献或uniprot来了解蛋白质剪切和修饰位点的大小。
第三，背景太高
在局部WB结果中，条带外本应空白的背景也会出现较暗的颜色，干扰分析结果，结果图也不美观，难以用于文章发表。该问题的可能原因如下:
①封锁不充分。背景高的一个主要原因是封锁有问题。建议使用合适的封闭剂(脱脂奶粉、BSA等。)优化反应浓度和封闭时间，同时注意防止抗体与封闭剂的交叉反应，以及封闭剂与靶抗原、内源性生物素或亲和素/链霉亲和素的配伍禁忌。
②膜清洗不充分。适当增加洗膜次数和放宽缓冲液体积，增加吐温20的百分比，可以改善洗膜不充分造成的背景高的问题；
③抗体的应用。一抗浓度高是背景高的原因之一，二抗可能与封闭剂非特异性分离，建议适当优化一抗浓度，设置二抗阴性对照。
④曝光时间长。建议在实验中采用适当的曝光时间。
四、条状分散或形状奇怪
有时候，波段在WB结果图中的位置符合预期，但由于波段分散、形状奇特等因素无法使用。这种情况多是制胶或电泳过程中出现问题造成的，如下:
①电泳时电压和电流过高。会导致条带迁移速度加快，SDS-PAGE温度升高，并可能导致条带分散变形。建议使用合适的电泳条件，坚持低温；
②电极不平衡。会导致试条偏斜，加载时在无样品的塑料孔中加入等量的样品缓冲液即可防止；
(3)当样品量过高时，样品中的盐离子浓度高。样品上样量过大可能导致谱带分散，样品中盐离子浓度的差异会导致谱带不均匀等问题。所以要保证样本量的不同和合适，坚持相同和较低的盐离子浓度。
④制胶的问题。调胶的时候一定要搅拌均匀。装样前，用针把胶孔拉直，把胶孔里的气泡吹出来。
⑤电泳缓冲液存放时间过长。电泳实验中缓冲液放置时间过长，会对结果产生不良影响，建议及时更换缓冲液。
五、膜上污渍分布不均
有时候WB做出一个结果后，除了目标条带外，还有不规则的污渍散落在胶片上，也会对结果产生很大的干扰。出现这种问题的主要原因如下:
(1)试剂、仪器等污染。建议注意每次实验前后实验仪器的清算，及时更换出现问题的试剂；
(2)转膜时有气泡。确保在薄膜转移过程中气泡被清除干净；
③孵育过程中抗体与膜接触不充分。保证抗体孵育过程中液体总量充足，同时均匀分配抗体，在摇动的情况下停止孵育；
④曝光时间。过度曝光会导致斑点更明显，建议采用合适的曝光时间；
⑤膜很无聊。实验中需要保证有足够的反应液，防止干膜出现。